黄连牡蛎膏外治痤疮作用机理的实验研究

2016-05-25 10:16:36   来源:西安海棠学院   

作者:谷建梅  徐姣   黑龙江中医药大学佳木斯学院

     [摘要]目的:建立痤疮实验模型,观察黄连牡蛎膏抗毛囊皮脂腺导管角化及抗表皮葡萄球菌皮肤感染的作用。方法:建立痤疮兔耳角化实验模型及痤疮表皮葡萄球菌感染模型,两组模型各分为5组,在每组造模部位分别外涂生理盐水、黄连牡蛎膏基质、高剂量黄连牡蛎膏、低剂量黄连牡蛎膏及阳性药,分别观察黄连牡蛎膏的抗角化及抗皮肤感染作用。结果:抗角化作用:与模型对照组(外涂生理盐水组)相比,高剂量药物组(P<0.01)、低剂量药物组(P<0.05)、阳性药组(P<0.05),基质组(P>0.05)。抗皮肤感染作用:与模型对照组(外涂生理盐水组)相比,高剂量药物组(P<0.01)、低剂量药物组(P<0.05)、阳性药组(P<0.01),基质组(P>0.05)。结论:黄连牡蛎膏具有抗毛囊皮脂腺导管角化及抗皮肤感染作用。
    [关键词] 黄连牡蛎膏  外用  痤疮  抗角化 表皮葡萄球菌
    痤疮是一种常见的毛囊皮脂腺慢性炎症,发病率较高,90%以上的青春期男女可有不同程度的皮损[1],严重者会遗留凹陷疤痕、瘢痕疙瘩,影响患者的面部美观,是一种最为常见的损容性皮肤疾病。该病病因及发病机理较为复杂,性激素分泌及对皮脂腺的调控异常[2,3、毛囊皮脂腺导管角化异常、毛囊内微生物、炎症损害及免疫反应等均参与痤疮的整个发病过程[4]。根据痤疮的发病机制,采用Kligman法建立痤疮兔耳实验模型,并用黄连牡蛎膏外用进行治疗,观察其对痤疮发病机制中出现的毛囊皮脂腺导管角化异常方面的治疗作用。痤疮还与毛囊皮脂腺发生细菌感染有关,常见的致病菌有痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌等。鉴于国内目前无痤疮丙酸杆菌的菌株供应,本实验采用在白兔腹部皮内注射表皮葡萄球菌菌液的方法制造表皮葡萄球菌皮肤感染模型后,通过每天外涂药物,观察药物对感染部位皮肤病变的改善情况。
1 黄连牡蛎膏抗毛囊皮脂腺导管角化作用的研究
1.1 材料
1.1.1 动物 健康白色雄兔20只,体重2000~2500g(由黑龙江中医药大学实验动物中心提供)。
1.1.2 药品及试剂  0.1%维A酸乳膏(重庆华邦制药股份有限公司);煤焦油(黑龙江省佳木斯市煤气公司提供),为黑色、糊状; 制备黄连牡蛎膏所需药材(黄连、煅牡蛎、丹参、薏苡仁、红花及紫草)均购自于佳木斯药材公司;制备黄连牡蛎膏所需基质原料(液体石蜡、甘油及305乳化剂)均购自于哈尔滨市鑫龙化妆品原料商店。
    基质的制备:按配方要求(液体石蜡10g,甘油7g,305乳化剂3g,蒸馏水80ml),准确称取各原料于同一烧杯中,朝同一方向搅拌直至成为白色细腻膏体即可。
    中药提取液的制备:准确称量黄连、丹参、薏苡仁各40g,紫草20g,红花10g,混合后用70%乙醇溶液回流提取,提取2次,每次1小时,合并滤液并浓缩至浓度为1.25g生药/ml后待用。
    高剂量黄连牡蛎膏的制备:按配方要求(液体石蜡10g,甘油7g,305乳化剂5g,中药提取液60 ml,黄连细粉5g,煅牡蛎细粉10g,蒸馏水加至100g),准确称取液体石蜡、甘油、305乳化剂、中药提取液及蒸馏水于同一烧杯中,朝同一方向搅拌,待成膏并膏体细腻后,加入中药细粉,继续搅拌,使中药细粉均匀分散于膏体中即可。
    低剂量黄连牡蛎膏的制备:配方为:液体石蜡10g,甘油7g,305乳化剂5g,中药提取液30 ml,黄连细粉2.5g,煅牡蛎细粉5g,蒸馏水加至100g。制备方法与高剂量黄连牡蛎膏相同。
1.1.3 仪器 OLYMPUS BX41系统显微镜;KD-2508型切片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 分组  将20只健康雄性白兔随机分为六组,分别为正常对照组、模型对照组、基质对照组、阳性药对照组、黄连牡蛎膏高剂量组及黄连牡蛎膏低剂量组,除黄连牡蛎膏高、低剂量组每组均为4只外,其余4组每组均为3只。 
1.2.2 造模  除对正常对照组白兔不做任何处理外;其余5组白兔,分别在每只白兔左右耳内侧耳管开口处2cm×2cm范围内,每天外涂煤焦油1次,每次涂0.25ml,连续2周。于第14d,随机取2只造模白兔进行皮肤活检,证实已造模成功。
1.2.3 用药  采用外用给药法。分别在模型对照组、基质对照组、阳性药对照组、黄连牡蛎膏高剂量组及黄连牡蛎膏低剂量各组白兔左右耳造模部位涂生理盐水0.1ml、黄连牡蛎膏基质0.1g、0.1%维A酸乳膏0.1g、高剂量黄连牡蛎膏0.1g及低剂量黄连牡蛎膏0.1g,每日2次,连续2周。正常对照组仍不做任何处理。
1.2.4 取材与其组织病理改变级别的判定  于末次给药24h后,用3mm打孔器在兔耳涂药处打孔取材,制作耳片标本(皮肤全层),以10%福尔马林固定后并送病理,HE染色后,光镜下观察病理组织学改变。  
    按其表皮增后及毛囊口扩张程度和角化物多少将标本的病理变化分为四级:“0”为无粉刺;“+”为毛囊漏斗部可见少量致密角化物;“++”为毛囊漏斗部可见中等量角化物,并向皮脂腺延伸;“+++”为扩张的毛囊内有广泛的角化物。
1.3 结果
1.3.1 给药后各组兔耳肉眼观察
    正常对照组:兔耳菲薄柔软,可见清晰毛细血管,兔耳耳管开口处可见毛囊排列整齐,大小均匀。
    模型对照组:涂煤焦油1周后,可见造模区耳部厚度增加,变硬,毛囊口有黑色角栓,涂煤焦油2周后,可见造模部位毛囊口有明显角栓,呈黑头粉刺状,毛囊口隆起呈丘疹状,整个兔耳表面粗糙。又经过2周外涂生理盐水后,造模部位耳部仍可见明显的毛囊角栓,但丘疹略减轻、变平。
    各药物治疗组:经给药2周治疗后,耳部增厚不同程度减轻,局部毛囊角栓减少,部分角栓脱落后遗留点状凹陷的毛囊,丘疹变平、减少。基质对照组改变不明显。
1.3.2 给药后各组兔耳光镜下组织学观察
    正常对照组:表皮较薄,表皮、真皮交界清楚,可见毛囊。模型对照组:可见表皮及毛囊上皮不规则增生,角化过度,毛孔扩张,其中充满角化物质,相邻的毛囊相互融合,毛囊漏斗部扩大如壶状。各药物治疗组:表皮增厚不同程度减轻,无毛囊口扩张或部分毛囊口轻度扩张,有极少量到少量疏松角化物质充填,未见毛囊漏斗部扩大如壶状。基质对照组:毛囊扩张及角化物质充填程度稍有减轻,但不明显。
    组织病理检查的分级结果见表1:
表1:黄连牡蛎膏对兔耳实验性角化模型的影响
组别 例数 组织病理学改变 P值
  (n) 0级 + ++ +++
正常对照组 6 6        
模型对照组 6     2 4  
黄连牡蛎膏基质组 6     4 2 P>0.05
0.1%维A酸乳膏组 6   3 3   P<0.05
低剂量黄连牡蛎膏组 8   4 4   P<0.05
高剂量黄连牡蛎膏组 8 1 7     P<0.01
    注:采用秩和检验,各治疗组均与模型对照组进行组间比较。
    表1结果表明,黄连牡蛎膏外搽兔耳角化部位的皮肤,可减轻皮肤毛囊皮脂腺导管的过度角化,组织病理学改善呈剂量依赖性。
2 黄连牡蛎膏抗表皮葡萄球菌的皮肤感染研究
2.1 材料
2.1.1实验动物  健康白色雄兔20只,体重2000~2500g(由黑龙江中医药大学实验动物中心提供)。
2.1.2 药品及试剂  表皮葡萄球菌真空冷冻干燥菌种:中国科学院微生物研究所(菌种编号1.2429);1%红霉素乳膏:芜湖三益制药有限公司;高剂量黄连牡蛎膏,低剂量黄连牡蛎膏。
2.2 方法
2.2.1 表皮葡萄球菌菌种的恢复培养  浸过75%酒精的脱脂棉搽净安瓿管,用火焰加热其顶端,滴少量无菌水至加热顶端破裂,用锉刀敲下已破裂的安瓿管顶端。用1ml无菌吸管吸取0.3ml~0.5ml液体培养基,滴入安瓿管内,轻轻振荡,使冻干菌体溶解呈悬浮状,吸取全部菌体悬浮液,移植于斜面培养基(蛋白胨10g,牛肉提取物3g,NaCl 5g,蒸馏水1.0升,pH7.0)上,置培养箱内37℃下培养72h,待菌落长出后,用生理盐水稀释为109个ml-1菌液。
2.2.2 动物分组  与上组实验分组方法相同。
2.2.3 造模  将健康白兔腹部两侧用脱毛剂脱毛,除于正常对照组外,分别于其余各组白兔腹部两侧皮内注射表皮葡萄球菌菌液(浓度为109个/ml)0.4ml,按同法于正常对照组腹部两侧注射生理盐水。
2.2.4 用药  于造模24h后开始用药。除正常对照组和模型对照组在造模部位外涂生理盐水0.1ml外,黄连牡蛎膏基质组、红霉素软膏组、黄连牡蛎膏高剂量组及黄连牡蛎膏低剂量组在白兔腹部造模部位分别涂以相应药物0.1g,每天2次,连续7天。
2.2.5检测指标与统计分析  记录每天用药后各组白兔腹部试验区的皮肤病变情况,按判断标准对其进行分级,采用秩和检验进行比较组间差异性。表皮葡萄球菌感染皮肤病变级别的判断标准如下:
    0级:注射后液体迅速吸收,未出现皮肤红肿和皮内硬块。
    1级:注射后皮肤红肿,但无皮内硬块。
    2级:注射后皮肤红肿,皮内硬块直径<1cm。
    3级:注射后皮肤明显红肿,皮内硬块直径≥1cm,并出现溃烂。
2.3 结果
    黄连牡蛎膏对表皮葡萄球菌皮肤感染模型影响的实验结果和秩和检验见表2和表3。
表2  黄连牡蛎膏对家兔表皮葡萄球菌皮肤感染模型的影响
组别 动物
(只)
皮内感染病变情况
第1d 第2d 第3d 第4d 第5d 第6d 第7d
正常对照组 6 000000 000000 000000 000000 000000 000000 000000
模型对照组 6 011011 232021 222021 112021 011021 011011 011010
基质对照组 6 110101 320222 220123 210112 210111 210101 110001
阳性药对照组 6 010010 110110 110100 010000 010000 000000 000000
药物高剂量组 6 100111 110111 100101 100000 000000 000000 000000
药物低剂量组 6 111010 121020 111010 010010 010010 010000 000000
注:表中药物高剂量组和药物低剂量组是指黄连牡蛎膏高剂量组和黄连牡蛎膏低剂量组
表3  黄连牡蛎膏对家兔表皮葡萄球菌皮肤感染模型影响的秩和检验
比较的组别 P值    比较的组别 P值 比较的组别 P值
阳性药与模型组 <0.01 阳性药与基质组 <0.01 模型组与基质组 >0.05
药物高剂量与模型组 <0.01 药物高剂量与基质组 <0.01    
药物低剂量与模型组 <0.05 药物低剂量与基质组 <0.05    
注:表中药物高剂量组和药物低剂量组是指黄连牡蛎膏高剂量组和黄连牡蛎膏低剂量组
由表2和表3可知,各实验组对家兔表皮葡萄球菌皮肤感染模型影响进行组间比较,模型组与基质组的差异无显著性意义,说明黄连牡蛎膏基质对对家兔表皮葡萄球菌所致的皮肤感染无明显抑制作用;与模型组及基质组比较,黄连牡蛎膏高剂量组与其组间差异均具非常显著性意义,黄连牡蛎膏低剂量组与其组间差异也具显著性意义,说明黄连牡蛎膏能够明显抑制感染表皮葡萄球菌所致的细菌性炎症反应,并与剂量具有相关性。
3 讨论
 中医学认为,痤疮的发生主要与血热偏盛、肺胃积热、外感风热及气血凝塞、血瘀痰结等病因病机有关,分为肺经风热、湿热蕴结及痰湿凝结等证型[5]。黄连牡蛎膏以清热燥湿、活血散结为治法。方中黄连能清热燥湿、泻火解毒;牡蛎能软坚散结、收敛固涩,对皮脂分泌过多及结节性皮肤病均具治疗作用;薏苡仁清热渗湿;丹参、红花、紫草均能活血化瘀。其中外用薏苡仁内酯可加速皮层的血液循环,丹参酮有抗雄性激素及温和的雌激素样作用,紫草素少量使用可减缓皮肤的角质化,红花有类性激素样作用,可软化皮肤角质层,对于角质层增厚类疾病有效[5]。纵观方中各味药的作用机理,黄连牡蛎膏适用于湿热蕴结及痰湿凝结型痤疮,对痤疮发病机制中出现的毛囊皮脂腺导管角化异常及微生物感染具明显的治疗作用。

参考文献
[1] 赵鸿儒,赵大华.中药消痤霜对兔耳痤疮实验模型的干预效果[J].中国临床康复,2006,10(7):108-109
[2]于中蛟,陆洁,段昕所,等.痤疮患者皮损处雄激素受体的表达[J].中国麻风皮肤病杂志,2008,24( 6) : 433 - 435 
[3]程康.中医药抗痤疮机理研究近况[J].上海中医药杂志,2005,39(2):61-62
[4]赵俊茹,胡冬裴. 痤疮病因及外治法研究进展[J].现代中西医结合杂志,2015,24(9):1021-1023
[5]李贤俏,杨金生.痤疮的病因病机和外治法研究进展[J].中国中医基础医学杂志,2013,6(6):713-715
 

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